عدسته

تاريخ وتطور الطريقة

كذلك، منذ أكثر من قرن مضى، ذكر عالم التشريح الألماني فيرنر سبالثولز لأول مرة استخدام المذيبات العضوية للتنظيف (لجعل الأنسجة شفافة). ومع ذلك، مع بعض الاستثناءات (المراجعات)، تم على وجه التقريب نسيان تكنولوجيا الإنترنت في القرن العشرين بأكمله. بدأت نهضتهم في السنوات العشر الماضية، والتي يمكن أن تُعزى إلى شعبية تقنيات الفحص المجهري الفلورية المتقدمة، والتي يمكنها إجراء تجزئة بصرية للعينات (متحد البؤر، متعدد الفوتونات أو الفحص المجهري الورقي البصري).

كذلك، في تقنية الإزالة الفعلية، يكون المذيب العضوي الأول المستعمل عبارة عن خليط من كحول البنزيل وبنزوات البنزيل. استعمل المؤلف هذا الحل لتنظيف دماغ الفأر وجنين الفأر وجسم ذبابة الفاكهة السوداء تمامًا. تتمثل العيوب الرئيسية لهذا الحل في تبييض إشارة GFP وعدم كفاية التنظيف لأنسجة نخاع العظام عند الحيوانات البالغة. لذلك، تم اختبار الكثير من الكواشف الأخرى من أجل إيجاد توافق أكثر ملاءمة وشفافية GFP تم اختيار رباعي هيدرو الفوران وإيثر ثنائي بنزيل كذلك كأفضل قواعد الإزالة. بناءً على هذه النتائج، تم إصدار بروتوكول 3DISCO في عام 2012.

التجفيف المسبق باستخدام رباعي هيدرو الفوران

الغطس في ثنائي بنزيل الأثير (DBE) لمطابقة RI

بعد استخلاص الدهون بالاحتضان في ثنائي كلورو ميثان (DCM)

التطبيقات

في هذا الإطار، طُورت طرق الإزالة بما في ذلك 3DISCO في الأصل لأبحاث علم الأعصاب. يرجع السبب إلى التعقيد الكبير في مورفولوجيا ووظيفة الجهاز العصبي، وهي دراسة تستغرق وقتًا طويلاً وشاقة باستخدام طرق الأنسجة الكلاسيكية. لذلك، ركزت أغلب الدراسات على الجهاز العصبي المركزي للفئران (القوارض هي واحدة من الكائنات الحية النموذجية الرئيسية في علم الأعصاب). استعملها مؤلفو طريقة 3DISCO أولاً لدراسة تجديد الجهاز العصبي المركزي للفأر (CNS)، بما في ذلك عد الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية ورسم خرائط مسارات المحور العصبي بعد الإصابة. تم استخدام 3DISCO كذلك لرسم خريطة لتطور الجهاز العصبي المركزي للفأر. تم استخدام iDISCO المحسّن لدراسة نشاط ووظيفة الدماغ في مرضى الزهايمر ونماذج الفئران أو لرسم خرائط لويحات الأميلويد والتهاب الخلايا الدبقية والتهاب الأوعية الدموية وخصائص الدماغ الأخرى. تم استخدام تعديل uDISCO فيما بعد لرسم خرائط للخلايا العصبية أحادية الخلية بالكامل في الجهاز العصبي المركزي غير المقسم للفئران.

وفي هذا السياق، في السنوات الأخيرة، امتد تطبيق طريقة DISCO إلى الكثير من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك توطين الخلايا الجذعية أحادية الخلية المزروعة في أعضاء كاملة من الفئران، وتصوير أجنة بشرية كاملة في مراحل نمو مختلفة أو فحص وتشخيص أورام الأنسجة البشرية.

• انظر كذلك
• CLARITY
• CUBIC

إجراء

يتضمن بروتوكول 3DISCO ثلاث خطوات:

المبدأ والبروتوكول

وعلى صعيد آخر، العينات البيولوجية (الأنسجة) هي هياكل غير متجانسة تتكون من مركبات ذات مؤشرات انكسار مختلفة. مثلًا، RI للماء هو 1.33، والدهون والبروتينات نحو 1.40-1.45. نتيجة لذلك، ينتشر الضوء عبر مسار الأنسجة، مما يؤدي إلى انخفاض الدقة، بل ويختفي في العينات التي يزيد سمكها عن عشرات الميكرونات. سلسلة من الخطوات بما في ذلك الجفاف وإزالة الدهون من الأنسجة والحضانة اللاحقة والتصوير في وسط مع RI هي نفس بنية التصوير، وبالتالي تقليل تشتت الضوء والحصول على عينة شفافة.

علاوةً على ذلك، الإصلاح باستخدام بارافورمالدهيد (عادةً ما يتم إصلاحه بامتصاص العرق)، وأخيراً الملصق بالصبغة، عن طريق الحضن في محاليل مائية ذات تركيز متزايد (محاليل رباعي هيدرو فلورو ألكان 50٪، 70٪، 80٪ و 100٪) لتجفيف العينة. نظرًا لنقص مجموعات الكحول التفاعلية أو الألدهيدات أو الكيتونات، فإن THF أقل تفاعلًا ويمكن أن تحافظ على التألق بشكل أفضل من المحاليل الجافة الأخرى. بعد الجفاف، اشطف العينة أولاً في ثنائي كلورو ميثان (DCM)، ثم اشطفها أخيرًا في ثنائي بنزيل إيثر (DBE) لمطابقة معامل الانكسار للأنسجة والوسائط المحيطة، وبالتالي الحصول على عينة شفافة. في DBE، يتم تخزين العينات وتصويرها.

الوسم

كذلك، بروتوكول 3DISCO هو الأنسب للأنسجة الثابتة المميزة بفلوروفور قوي.يمكن للنموذج المعدّل وراثيًا المثالي التعبير عن البروتينات الفلورية، مثل GFP (أو يمكن كذلك تلطيخها بأصباغ اصطناعية). لتسمية الأجسام المضادة، تم تحسين طريقة 3DISCO وإصدارها تحت اسم iDISCO (انظر التعديلات والتطبيقات أدناه).

التعديلات

وفي هذا السياق، يشمل مؤلفو iDISCO (بمعنى «القدرة على إجراء التصوير المناعي للأعضاء التي يتم تنظيفها بالمذيبات») المعالجة المسبقة للعينات باستخدام الميثانول، وبيروكسيد الهيدروجين، والمنظفات، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، ويتم مسح الجسم المضاد مسبقًا ووضع علامات عليه. تتغلب هذه المعالجة المسبقة على عيبين من أوجه القصور في تصنيف عينات كبيرة من الأجسام المضادة. أولاً، يقلل من التألق الذاتي للعينة ويحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ ثانيًا، يجعل الأنسجة أكثر نفاذية للأجسام المضادة. نتيجة لذلك، يمكن تلطيخ العينات الكبيرة (مثل أجنة الفئران أو أعضاء الفأر بأكملها) بنجاح باستخدام الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية، ثم مسحها ضوئيًا وتصويرها.

ومن جهة أخرى، تم اعتماد طريقة 3DISCO وتعديلها بعد وقت قصير من نشرها من قبل باحثين آخرين من أجل تحقيق أهداف محددة، مثل استخدام الترجيع. أو وسم الجسم المضاد (iDISCO)، اغسل الفئران بأكملها (uDISCO) أو عينات البارافين المستقرة من الفورمالين (DEPCO).

وعلى صعيد آخر، DIPCO (من «تشخيص الأعضاء المطهرة الملصقة بالبارافين») عبارة عن خط أنابيب يجمع بين إزالة الكافيين لعينات الورم المضمن بـ FFPE، وإزالة iDISCO والنمذجة الظاهرية لأنسجة الورم. يتم تخزين عينات الورم FFPE على نطاق واسع في البنوك الحيوية واستخدامها للتشخيص، ويمكن أن يساعد تحليلها ثلاثي الأبعاد في تحسين التقسيم الطبقي لمرضى السرطان.

ومن ناحية أخرى، يعزز مؤلفو uDISCO (من «التصوير النهائي للأعضاء الخالية من المذيبات») انكماش الأنسجة، وهو تأثير متفرج شائع لإزالة الجفاف من العينة في الخطوة الأولى. استعملوا ثلاثي بوتانول بدلاً من THF للجفاف، واستعملوا كذلك مستحلبًا آخر للتصوير، مما يجعله لامعًا أفضل من DBE. بسبب انكماش الأنسجة، يمكنهم مراقبة عينات بحجم جسم الفأر بأكمله. تجدر الإشارة إلى أن uDISCO ظهرت في وسائل الإعلام في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك نيويورك تايمز ووول ستريت جورنال وBusiness Insider والطبيعة والعلوم. تم اختيارها كذلك من قبل مجلة Nature كواحدة من أفضل عشر صور علمية لعام 2016.

التعديلات والتطبيقات

ومن ناحية أخرى، يرجى ملاحظة أن هذا الفصل يصف تطوير واستخدام طرق التنظيف القائمة على المذيبات، ولا يقدم قائمة كاملة بالتطبيقات والتعديلات.

مزايا وعيوب

إضافةً إلى ذلك، العملية برمتها سهلة التنفيذ نسبيًا، تحتاج فقط إلى تغيير الحل المحدد، بدون بعض المعدات المختبرية الخاصة. تكون العملية بعد الإزالة والتصوير سريعة جدًا (ساعات إلى أيام، اعتمادًا على حجم العينة)، خاصةً مع التقسيم المادي للعضو بأكمله وتصوير أجزائه المختلفة وإعادة بنائها قبل تحليل الصورة اللاحق (قد يتطلب عدة أسابيع). فضلًا عن ذلك، يمكن لـ 3DISCO التأثير على الكثير من الأنسجة (الرئة والطحال والغدد الليمفاوية والثدي والأورام).

من جهة ثانية، العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو إزالة جزء من الأنسجة الدهنية مع إزالة الاستخدام المنفصل للأصباغ المحبة للدهون، وانكماش الأنسجة أثناء عملية الإزالة. حلل التحلل الكامل للفلورة أثناء التخزين طويل الأمد وسمية المواد المستعملة ككاشف (وقدرتها على تدمير هدف المجهر في حالة حدوث تسرب في غرفة التصوير).