لطخة ساوثرن

النتائج

وفي هذا السياق، تهجين قطعه (probe) إلى قطعة حمض نووي محدده على الغشاء يدل على ان الحمض النووي يحتوي على ترتيب مكمل للترتيب الموجود على (probe). خطوة نقل الحمض النووي (DNA(من الجل الكهربائي إلى الغشاء تسهل ربط القطعة المعلمة مع قطعه الحمض النووي المفصولة حسب الحجم. وايضا يسمح بتثبيت probe الذي نحتاجه ويتم تحليله من خلال التصوير الاشعاعي الذاتي أو طرق كشف أخرى.وصمة ساذرن متشكله مع انزيم يعمل على تقطيع الحمض النووي وقد يستعمل لمعرفة عدد الترتييبات (عدد الجينات) في الجينوم. قطعه ((probeالتي تهجن إلى قطعه واحدة من الحمض النووي والتي لم يتم تقسيمها بواسطة انزيم التقطيع سوف تعطي شريط واحد على وصمة ساذرين بالمقابل عدة أشرطة غالباً سوف تنتج عندم يتم تهجين ((probeإلى عدة قطع متشابهة الترتيب بدرجة كبيرة (تلك التي تنتج من عملية تضاعف الحمض النووي أثناء انقسام الخلية)

من جانب آخر، تغير ظروف التهجين (مثال زيادة درجة الحرارة أو نقصان تركيز الاملاح) تستعمل لزيادة التحديد والخصوصية لتسلسل النيكليوتايد لقطعة (probe) وانقاص تهجين ال ((probe إلى ترتيبات بنسب تشابه أقل من 100%.

التطبيقات

من جهة ثانية، وصمة ساذرين تستعمل لعملية الإستنساخ المعتمدة على تطابق ترتيب الحمض الأميني للبروتين الناتج مع الجين المستهدف النكليوتايدات المتعدة مصممة حتى ينتج ترتيب مماثل للترتيب المستهدف.

وفي السياق ذاته، التسلسل المهجن النيكليوتايد المهجن بواسطة (probe) يتم تحليلها بشكل أكبر، مثلًا، للحصول على الترتيب الكامل للجين المراد. كذلك وصمه ساذرن يمكن ان تستعمل لتحديد مواقع مجموعة الميثل في جين محدد.

من جانب آخر، وعمليا المفيد هو الانزيمات القاطعة (MspI, HpaII) كلاهما ينظم ويقسم على نفس تسلسل النيكليوتايد. ولكن،HpaII يحتاج أن يوجد ميثل على (سايتوسن نيكليوتايد)في ذلك المكان، بينما، MspI يقسمالحمض النووي عند المواقع التي لاتحتوي على مجموعة المثيل لذلك، أي مواقع تحتوي على مجموعة المثيل الموجودة في الترتيب المراد تحليله مع قطعة (PROBE) معينة يتم تقطيعها من خلال انزيم المذكور اولا وليس لاخير.

علاوةً على ذلك، متعدد النيكليوتايد يصنع كيميائيا وهو مميز اشعاعيا، ويستعمل لعرض مجموعة الحمض النووي، أو مجموعات أخرى من الحمض النووي المستنسخ.

الطريقة

وفي هذا السياق، 5- يتم وضع غشاء مكون من النايتروسيليلوز (أو نايلون) فوق الجل (أو تحته، تعتمد على اتجاه الانتقال).ثميتم تطبيق ضغط على الجل (اما باستخدام الشفط أو من خلال وضع كمية كبيرة من الفاين الورقي ووزن أعلى الغشاء والجل), للتاكد من انه قدم تم اتصال كامل ومتساوي بين الجل والغشاء. إذا تم النقل من خلال الشفط، 20x SSC , يتم استخدام محلول منظِّم (buffer)للتاكد من الاغلاق التام ومنع جفاف الجل.يتم نقل المحلول المنظِّم (buffer) من خلال الخاصية الشعرية من منطقة مياه ذات تركيز عالي إلى منطقه تركيز منخفض (عادة ورق الفلترة وورق الفاين) وبعدها يستعمل لنقل الحض النووي من الجل إلى الغشاء: تفاعلات تبادل تؤدي لربط الحمض النووي إلى جعل الغشاء بسبب الشحنة السالبة للحمض النووي والشحنة الموجبة للغشاء.

ومن ناحية أخرى، 8- بعد التهجين، قطع (probe) الزائدة تغسل من الغشاء (كذلك باستخدام (SDS buffer), ويتم مشاهدة عملية التهجين من خلال اشعة اكس باستخدام التصوير الاشعاعي الذاتي في حالة المواد النشطة اشعاعيا أو المشعة، أو من خلال تطوير اللون على الغشاء باستخدام طريقة اكتشاف تولد اللون.

وفي هذا الصدد، 2- جزيئات الحمض النووي يتم تعريضها إلى كهرباء في جل يسمى (اغاروز) لتفصلهم حسب الحجم.

ومن ناحية أخرى، 3- إذا كانت جزيئات الحمض النووي أكبر من 15kb , نقوم قبل الوصمة بمعالجة الجل بحمض مثل حمض الهيدروكلورايد المخفف.و هذا يزيل (purine

وفي هذا السياق، 1- تستعمل انزيمات الاقتطاع الداخلية لقطع الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي الكبير إلى جزيئات صغيرة.

علاوةً على ذلك، 4- إذا تم استخدام طريقة النقل القاعدي، يتم وضع جل الحمض النووي في محلول قاعدي (عادة تكون صوديوم هيدروكسايد) حتى يتم تفكيك السلسلة المزدوجة للحمض النووي، عملية التفكيك (التمسيخ) في بيئه قاعديه قد يحسن الرابطة بين الثايمين سالب الشحنة في الحمض النووي ومجموعة الامين موجبة الشحنة في الغشاء، يعمل على فصل الحمض النووي إلى سلسلة واحدة للتهجين في وقت آخر (انظر في الاسفل) ولتحطيم أي بقايا من الحمض النووي (RNA). اختيار الوسط القاعدي بدل المتعادل هي عملية تجريبية وقد تؤدي إلى نفس النتائج.

ومن جهة أخرى، 7- يعرض الغشاء إلى قطعه مهجنة من الحمض النووي - هي عبارة عن قطعة من سلسله (DNA) واحدة تحتوى ترتيب معين من النيكلوتايد موجود بسلسله الحمض النووي المراد فحصها وتحديدها. وهذه القطعة المهجنة يتم تعليمها حتى نتمكن من كشفها، عادة ما يتم تميزها بدمجها مع جزيئات مشعه أو اصباغ مشعه تنتج الوان. في بعض الحالات، قد تصنع هذه القطعة المهجنة من (RNA). للتاكد من خصوصية ارتباط هذه القطعة مع عينة الحمض النووي، يتم استخدام الحمض النووي الموجود في الحيوان المنوي لسمك السلمون اوسمك الرنجة لتغلق سطح الغشاء وتخخصه للحمض النووي في العينة ومادة الفورماميد منزوعة التأين، ومطهر مثل (SDS) لاختزال الروابط الغير مخصصة في القطعة.

ومن ناحية أخرى، ) من جزيئات الحمض النووي، ويكسره إلى جزيئات اصغر مما يؤدي إلى نقل الحمض النووي بكفاءه أكثر من الجل إلى الغشاء.

وعلى صعيد آخر، 6- ينقل الغشاء ليتم خبزه في فرن فراغي أو فرن منتظم على درجة حرارة 80سيلسوس لمدة ساعتين (تحت ظروف معيارية: غشاء النايتروسيليلوز أو نالون) أو يتم تعريضه للاشعة فوق البنفسجية (غشاء النايلون) حتى يلتصق الحمض النووي المنقول (DNA) بالغشاء بشكل دائم.